上户口亲子鉴定序列多态性PCR标记系统

 1、pull-up峰，多色荧光标记检测系统中，由于有机荧光染料发射光谱较宽，不同荧光之间相互有干扰，产生干扰峰，称之为pull-up峰。不过这种峰的峰形与真正的等位基因峰不同，而且出现的位置与另一颜色的峰位置一致，较容易区分开。

    2、非产物荧光污染  一些具有荧光的物质如抗生素、维生素、多环芳香物、荧光素发生体和染料等在电泳图中出现与DNA荧光片段相同的峰，可能会干扰DNA分型，影响鉴定结果。Chelex DNA提取方法甚至有机提取法不能去除抗生素、维生紊、多环芳香物、荧光紊发生体、各种染料等，以Chelex提取法提取的DNA为模板的PCR产物常伴有荧光污染峰。不过，干扰峰通常较宽，比较容易与荧光素染料标记的PCR产物峰区分开来。

    非产物荧光污染产生有以下四种可能的情况：一是带色载体上的体液斑，在提取过程中染料被浸了下来；二是植物体上的体液斑，叶绿紊可能与DNA同时提取出来；三是病理状态下个体的血或组织样品，如铅中毒、某些形式的卟啉症，此时血中的卟啉浓度大幅度提高；四是年轻时曾接受过环组抗生素治疗的个体的牙或骨组织（成长的骨和牙齿吸收、蓄积了这些抗生素）。采用空白基质（载体）对照实验，或将未扩增的物质与PCR扩增产物一起电泳检测进行比较，确定是否有非产物污染峰。

    3、样品为混合样品  当分析样品为混合样品时，经常出现多带现象，这是造成额外带

的最常见原因。混合样品情况将在后面详细介绍。

    ⑥电泳条件不适当  FGA基因座的带会移到vWA基因座区域，造成vWA基因座有三条带，而FGA基因座只有一条带，重新电泳检测可克服。

    4、一些复合扩增体系中，同一颜色的基因座间等位基因片段有些交叉，主要是一些片段较大的或较小的稀有碱基位于某一基因座的等位基因内部。如FCA的稀有等位基因14位于vWA基因座。

    5、模板DNA极微量、DNA降解、有抑制剂存在  模板DNA极微量或DNA降解或有抑制剂存在，在PCR开始几个循环，引物退火的随机差异，导致某一个等位基因优先扩增。另外，当一对等位基因的大小差异很显著时，也可引起一个等位基因的优先扩增。

    如果一基因座二个峰高比值小于70%．而没有其他指标表明是混合样品，那么该样品必须重新扩增以确定不平衡情况是否有重复性。不平衡扩增提示标本可能为混合样品。

    模板DNA极微量或DNA降解或有抑制剂存在，不同基因座扩增效率不同，有些基因座不能得到扩增，片段较大的基因座最先受到影响，如D7S820，D18S51，FGA基因座。

    6、引物结合位置的序列差异模板DNA的引物结合位置出现突变，可能直接影响退火效率，尤其是突变发生在引物的3’端，延伸可完全被阻断，使某个等位基因无扩增产物，成为无效等位基因(null allele)，杂合子个体只有一个基因产物，成为所谓假纯合子的现象，如MBP -B、D19S253及Profile plus中D8S1179基因座均可出现上述无效等位基因，不过这种情况造成的假纯合子的等位基因峰高比真正纯合子的低许多，由此来确定是否存在无效等位基因。如果突变发生在引物结合的其他位置，引物退火温度受到影响，导致信号降低。

    没有一对引物可以绝对地说没有无效等位基因现象。引物位置点突变发生的机率极小

（大约0.01?0.0001基因座），一个个体不可能在二个基因座受到影响。改变引物序列，避开前一引物退火区域，可以克服无效等位基因的问题。

    不管怎样，只要用同一套引物相同条件分析现场物证与比对样品，如果现场物证分型与嫌疑人的相同，说明它们来自于同一来源，无须考虑无效等位基因问题。这种情况只适合于一个实验室内。如果建立数据库，实现数据共享，进行联网比对，潜在的等位基因丢失可能导致假排除。为了克服这个潜在的问题，需要降低数据库搜索的标准，允许可以有一个基因座不完全匹配，而不是所有基因座必须完全匹配。但无效等位基因对于亲子鉴定，存在假排除的可能，要引起注意。  ’

    7、样品为混合样品在实际检验中，明显干扰峰面积平衡的常见原因是混合样品，而不是等位基因的优先扩增。

    当分析样品为混合样品时，混合样品组分的混合比例不同或混合的比例相同但拥有一个共同的等位基因，可能会发生这种基因座内的优先扩增现象，等位基因峰面积明显不平衡。扩增分析多个基因座，综合分析整个图谱，确定是否为混合样品，有助于结果的解释。

    8、微变异体与稀有等位基因  由于碱基插入、缺失或变化造成等位基因序列差异，一些重复单位碱基数发生变化，等位基因内部有不完整的重复单位存在，这些微变异体与完整重复单位的等位基因差异极其微小，而且比较稀有，不包含在分型标准物中，与分型标准物中等位基因只差．1到2个碱基。

    D18S51，D21S11和FGA基因座出现微变异体较多，“．1”、“．2”、“．3”，很难辨认，很难进行正确命名。如果命名不正确，会导致结果错误，尤其是进人数据库进行比对。要求认真检查分子量内标，确认等位基因的片段大小，证实确为稀有等位基因，进行正确命

名。

    一些片段较大或较小的等位基因，可能落在该基凶座等位基因分型标准物两侧以外，在排除“pull-up”峰和非特异性扩增产物外，必须将此峰作为真正的等位基因来处理，按国际命名标准进行命名。

    9、部分X和Y染色体序列表现出高度的序列相似性一些Y- STR基因座即使采用非常特异的扩增条件，女性DNA仍能在Y- STR基因座得到扩增产物，表观表现为二个男性DNA混合的样品。因此，对于这些基因座，要求用案件涉及的女性样品作对照同时进行分析，以确认是否有女性的干扰。