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广西亲子鉴定PCR退火的温度与时间

来源： 柳州中正亲子鉴定中心 日期：2013-10-10 点击： 130 属于： 鉴定知识

变性温度是PCR反应的成败关键，退火温度决定着PCR的特异性。变性后DNA很快冷却，可使引物和DNA结合。引物退火温度与时间取决于引物的碱基组成（G+C含量）、长度和浓度。长度在15 - 25bp，引物退火温度Tm=4(G+C)+2(A+T)，引物过长，计算所得Tm会偏高。合适的退火温度应比Tm低5℃。在广西亲子鉴定中心实际反应中可能应以较Tm低6-8℃开始为宜，逐渐增加，每次2℃。

选择合适的退火温度可以增高广西亲子鉴定反应的产率，大大减少引物与模板的非特异结合，提高PCR反应的特异性。由于反应体系中，初始状态下存在过量的引物，在开始几个循环选用稍高一点的温度，可能有助于提高反应的特异性。从表中可根据AT与GC的个数，从其交叉点迅速查出较为合适的退火温度。有资料表明根据此表指导分析50对引物PCR的最适退火温度，其中有49对引物的实验值与计算值相差在4℃以内。

当引物长度为12一15bp时，Tm值可能只有40一45℃。这样的引物不可能在72℃保持退火状态。因此，这类反应需要利用Taq酶在较低温度下的活性，将反应在50—60℃保温或将温度缓慢地升到72℃来完成整个反应。

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