引物延伸结合变性高压液相色谱法

1．广西胎儿亲子鉴定根据引物延伸法原理

    引物延伸法原理类似于微型测序方法，首先扩增出含有SNP的一段DNA，然后一个寡核苷酸引物直接在多态性碱基上游或下游发生退火，在底物dNTP和ddNTP存在下，进行一个或几个碱基的延伸。延伸的碱基数目取决于多态性位置的碱基。寡核苷酸引物的端碱基紧挨于多态性碱基，引物开始延伸的第一个碱基就是多态性碱基。然后根据延伸产物的大小确定等位基因。关于引物延伸产物的检测，已报道了许多方法，如放射性同位素标记法、发光检测法、显色反应，凝胶为基础的荧光检测法和质谱分析法、变性高压液相色谱法。

    2．广西胎儿亲子鉴定根据变性高压液相色谱原理

    变性高压液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography，DHPIJC)又叫温度调控高效液相色谱(temperature - modulated high performance liquid chromatography，TmHPLC)，是一种新的高通量的DNA序列多态性分析技术。该技术最早由美国Stanford大学Oefner及Underhill等报道的，其原理是用离子对反向高压液相色谱分离检测异源双链。优点是加样和分析的自动化，引物延伸后不需要进行纯化过程，是比较简便的SNP分析方法，而且多个SNP可以复合在一起。

    3．广西胎儿亲子鉴定机构用DPHLC分析SNP

    取15VI引物延伸产物，用Dynamax自动加样器（AI-96）在700C下加到SarSepDNAsep柱（‘r~sgenomic，Santa Clara，Calif，USA）上，用含乙晴线性梯度的0.Imol/LTEAA (pH7.0)洗脱将引物延伸产物从柱上洗脱下来，洗脱梯度由O.lmol/L TEAA(pH7.0)+O.lmmol/L EDTA - Na2与O.lmol/L TEAA (pH7.0)+25%乙晴混合而成。TEAA的作用是与DNA分子形成离子对，使DNA分子呈电中性，吸附在经硅烷基化处理的色谱柱上。乙晴作为洗脱剂，将TEAA和DNA分子复合体从色谱柱上洗脱下来。

    根据DNA片段大小和片断单链的组成顺序从柱上洗脱下来，以峰的形式被记录下来，第一个峰为掺人的引物峰，然后是引物延伸产物峰，根据峰的个数和对称性，确定基因型。杂合子个体出现二个峰，但在分离度不够的情况下，往往出现肩峰及不对称峰。