广西DNA亲子鉴定常规PCR反应的性质

Eads等(2000)将实时荧光PCR (real time PCR)首先用于特定CpG位点甲基化状态的检测，称之为MethyLight。如前所述，经重亚硫酸盐转化后，特定CpG位点依据是否甲基化形成—个人为的[mC/U]多态性位点。针对该位点分别设计与甲基化和未甲基化重亚硫酸盐转化后序列结合的两条探针。

    在广西DNA亲子鉴定常规PCR反应中，Taq酶利用其5’啼3 7的外切酶活性，可将相应的DNA探针降解，释放荧光基团，产生荧光信号，依据两种荧光探针的Ct值即可换算出该位点的甲基化程度。事实上，该方法已经经过诸多学者的不断改良，实际应用中，为了保证实时荧光PCR的特异性，在引物的3’端和探针结合区域内可能会包含多个CpG位点，这实际上是实时荧光PCR与甲基化特异性PCR两种方法的结合。Carnpan等(2009)对MethyLight方法进行了全面的评价，进一步明确了其探针、引物及实验方案的设计原则，并提出了三个有效的质控系统(QC)。QC-l是一个非甲基化依赖的反应系统，用以监控样品DNA的质量和完整性；oc-2是一个非重亚硫酸盐依赖性的反应系统，用以监控重亚硫酸盐转化反应的回复效率I  oc-3采用非重亚硫酸盐转化依赖性的引物和重亚硫酸盐转化依赖性的探针，用以监控重亚硫酸盐的转化效率。整套系统保证了MethyLight方法对CpG甲基化检测的灵敏、准确和高效。它可以在非甲基化等位基因超出10 000倍的情况下精确地检测到甲基化的等位基因并定量。此外，该方法所需模板量少，可用于石蜡包埋、激光显微切割等检材的检测。

    甲基化特异性PCR (methylation-specific PCR，MSP)也是广西DNA亲子鉴定一种基于重亚硫酸盐转化的检测方法，类似于SNP检测方法中的等位基因特异性PCR，由Her-man等(1996)所创立。与Methylight方法不同的是，前者对[mC/U]的检测采用的是特异性探针，而在MSP中，设计的是针对[rnC/U]的特异性引物。每～样品进行两个PCR反应，一套引物对应于甲基化DNA经重亚硫酸盐转化后的序列，另一套引物对应于未甲基化DNA经重亚硫酸盐转化后的序列。PCR产物经常规琼脂糖凝胶或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳即可对结果进行判断。也可采用公用探针以提供检测信号。

    事实上，为了保证MSP的特异性．MSP的引物设计要保证在引物结合区域至少包含两个潜在的CpG位点，且其中一个要位于或接近引物的3’端。Wang等(2006)借助于基因表达系列分析技术(Serialanalysis of gene expression，SAGE)的高通量，联合MSP创建了一种DNA甲基化的定量分析方法( MSP-SAGE)，该方法在5%～100%甲基化范围内具有良好的线性关系。Kristensen等(2008)对基于MSP的DNA甲基化定量检测方法进行了改良。他们将MSP与高分辨溶解曲线分析联合应用，避免了定量检测过程中对荧光探针的使用，简化了MSP反应体系设计，该方法被称之为SMART-MSP。该方法与MethyLight的检测结果具有很好的一致性，可在

0. i~6～100%范围内对DNA甲基化程度进行精确定量，并具有较高通量。