广西DNA亲子鉴定前期的重要流程

1. 各种检材mLDNA的提取

      采用Chelex - 100方法提取mtDNA。

      2．mtDNA D- loop区的目的片段PCR扩增

      在50vl反应体系中，含有lOymol/L Tria-HCl (pH8.3)，5qnnol/L KCI，1.5yrnol/L MgC12，200ymol/L dNTPs，lrumol/L每种引物，1.25u Taq DNA聚合酶，lOtul Chelex-100提取液。

      广西DNA亲子鉴定PCR热循环参数：94℃45s，50℃1rnin，72℃3 rrun，循环32次，最后72℃延伸6min。

      广西DNA亲子鉴定PCR扩增产物检测：取5vl扩增产物加在5%聚丙烯酰胺凝胶中，200v电压下电泳30min，银染法显色，观察是否得到扩增产物，是否具有特异性。

      对于毛发和骨骼mtDNA模板，由于量少，为了得到足够产量的测序模板，常用nested-PCR，以提高成功率。

      广西DNA亲子鉴定Nested-PCR的体系，包括第一步扩增和第二步扩增：

      第一步扩增：25Ill反应体系中，含有Chelex - 100提取的模板DNA 5pL1，200ptmol/L

dNTPs，0.5ymol/L引物L15997和H16401，10×缓冲液2.5vl，lu Taq DNA聚合酶。然后放人扩增仪中，进行扩增。循环参数为：94℃lmin，56℃30s，72℃2min，循环20次后，72℃保温7 rmn，最后4℃。如果使用血液或血痕提取的模板DNA，那么只需2up。

      第二步扩增：在50vl反应体系中，取第一步扩增产物DNA l - 2vl,  200ymol/L dNTPs，

0.5ymol/L引物L16072和H16328，10×缓冲液2.5vl，lu Taq DNA聚合酶。然后放入扩增仪中，进行扩增。循环参数为：94℃Imin，56℃30s，72℃90s，循环30次后，72cc保温7 min．最后4℃。

      3．mtDNA目的片段的纯化

      确认获得了mtDNA目的片段的扩增产物后，需将mtDNA目的片段从PCR扩增产物分离出来，与PCR反应中的引物等分开，因为PCR反应引物干扰测序反应。纯化的方法很多，目前较常用的是：(1)采用的Ptomega公司的Winzard试剂盒纯化；(2) Microcon 100超滤法(3) QIAGene试剂盒纯化。